遺伝子セットってなんだろう？

1. 序論：冬と夏の販売個数

同じスーパーで、冬と夏に何個売れたかを比べます。下の表は、各30日間の販売個数を並べた架空データです。金額ではなく、商品1個・1袋・1パックを1として数えています。

冬と夏の販売個数

架空データ · 全48商品

◆で示す集まり並び順

カレーの材料を◆で示した販売個数。同じ店舗の冬と夏、各30日間。
商品	冬（個）	夏（個）	増減率
·米	320	336	+5%
·食パン	400	380	−5%
·パスタ	180	198	+10%
·うどん	240	216	−10%
·そうめん	60	240	+300%
·小麦粉	140	126	−10%
◆カレールー	100	150	+50%
·シチュールー	160	80	−50%
·みそ	220	198	−10%
·しょうゆ	200	210	+5%
·食用油	180	189	+5%
·塩	100	105	+5%
◆たまねぎ	200	270	+35%
◆じゃがいも	200	260	+30%
◆にんじん	100	125	+25%
·キャベツ	180	171	−5%
·レタス	120	168	+40%
·トマト	160	256	+60%
·きゅうり	100	200	+100%
·なす	80	160	+100%
·大根	200	130	−35%
·ほうれん草	180	126	−30%
·しめじ	160	128	−20%
·もやし	300	315	+5%
·りんご	200	140	−30%
·バナナ	240	252	+5%
·みかん	300	60	−80%
·すいか	10	100	+900%
·鶏肉	320	352	+10%
·豚肉	300	330	+10%
·牛肉	160	176	+10%
·鮭	200	180	−10%
·さば	140	126	−10%
·豆腐	300	420	+40%
·納豆	280	294	+5%
·卵	400	400	0%
·牛乳	400	420	+5%
·ヨーグルト	240	264	+10%
·チーズ	180	171	−5%
·バター	120	108	−10%
·アイスクリーム	120	360	+200%
·麦茶	100	300	+200%
·ミネラルウォーター	400	640	+60%
·コーヒー	200	190	−5%
·ジュース	180	270	+50%
·チョコレート	240	144	−40%
·ポテトチップス	200	220	+10%
·シリアル	120	126	+5%

カレールーは100個から150個へ、50%増えています。たまねぎ、じゃがいも、にんじんも増えています。一つの商品だけでなく、関連する商品の集まりにも変化が見えます。

「カレーの材料」などの集まりは、売れた結果を見ずに決めておきます。たまねぎのように、複数の集まりに入る商品もあります。ただし、販売個数だけでは、特売や来店客数などの影響と、料理の流行を区別できません。

項目ごとの個数を並べたものがカウントデータです。遺伝子を調べるときも、行に遺伝子、列に試料を並べて比較します。

商品遺伝子

冬・夏の販売個数条件A・BのRNA由来のカウント

関連する商品関連する遺伝子

販売個数とRNAのカウントは別の量ですが、「同じ項目を、異なる条件で比べる」という表の読み方は共通です。

2. 遺伝子とRNA

遺伝子は、RNAを作る情報を持つDNAの領域です。タンパク質を作る遺伝子では、DNAの情報がmRNAに写され、そのmRNAをもとにタンパク質が作られます。

DNA → mRNA → タンパク質

DNAからRNAを作る過程を転写、mRNAからタンパク質を作る過程を翻訳と呼びます。

RNA量を測ると、どの遺伝子がどれくらい発現しているかを調べられます。ただし、翻訳や分解の影響もあるため、RNA量とタンパク質の量・働きは同じではありません。

3. shRNA

shRNAは、標的のmRNAを減らす仕組みに利用する短いRNAです。遺伝子産物の量を下げる操作をノックダウンと呼びます。DNAそのものを消す操作ではありません。

模式図

DNAは残したまま、mRNAを減らす

DNA情報のもと

転写

mRNA情報を写したもの

翻訳

タンパク質細胞で働く分子

1 / 3DNAからmRNAが作られる

DNAの情報をもとにmRNAが作られます。この過程を「転写」と呼びます。

図の要約：DNA → mRNA → タンパク質。shRNAは標的mRNAを減らす仕組みに利用され、DNAを消すものではありません。分子の数は実測値ではありません。

4. RNA-seqとカウント表

RNA-seqは、試料中のRNAに由来する配列を読み取り、遺伝子の発現量などを調べる方法です。遺伝子ごとに対応するリード（読み取った配列）などを数え、カウント表にまとめます。

表の1行は1遺伝子、1列は1試料です。条件AとBを比べるときも、各条件で複数の試料を測り、試料間のばらつきを調べます。

人工データ
遺伝子	A1	A2	A3	A4	A5	A6	B1	B2	B3	B4	B5	B6
DEMO01	80	97	73	79	73	87	38	14	23	34	16	20
DEMO02	105	95	89	108	122	75	26	55	60	35	23	32
DEMO03	135	36	133	123	145	85	126	1	61	28	1	49
DEMO04	1	137	21	75	75	275	39	219	240	105	211	257
DEMO05	161	169	201	170	170	136	111	91	93	100	133	151
DEMO06	169	165	204	207	188	144	112	179	144	161	178	139
DEMO07	177	253	196	309	210	184	204	178	11	259	201	285
DEMO08	13	47	31	190	110	129	73	95	137	156	197	128
DEMO09	98	98	94	101	91	100	175	161	145	156	143	155
DEMO10	125	88	163	63	112	129	235	258	235	280	250	287
DEMO11	118	124	150	161	137	91	371	401	271	427	366	197
DEMO12	79	61	215	326	187	280	525	396	490	565	289	566
DEMO13	171	206	156	158	184	181	53	45	95	25	40	63
DEMO14	247	101	210	65	171	231	105	1	61	123	14	79
DEMO15	95	94	113	71	63	53	13	47	78	55	91	36
DEMO16	207	86	45	127	21	166	1	97	116	27	1	151
DEMO17	111	110	124	120	140	117	94	81	96	96	98	82
DEMO18	103	111	158	173	149	107	182	112	110	98	117	113
DEMO19	85	137	189	385	198	171	98	181	181	141	67	144
DEMO20	173	96	255	132	199	268	155	148	337	31	250	292
DEMO21	198	197	197	219	206	214	356	317	312	282	301	356
DEMO22	79	115	86	21	66	83	157	178	161	156	132	157
DEMO23	210	111	112	99	142	116	233	303	232	305	267	181
DEMO24	10	136	262	161	71	1	355	327	428	450	399	380
DEMO25	154	126	125	138	134	162	142	147	163	162	152	140
DEMO26	148	161	245	186	203	135	155	123	124	125	125	134
DEMO27	149	1	149	217	140	226	168	168	108	97	68	189
DEMO28	196	142	421	144	248	459	236	275	164	260	71	56
DEMO29	72	70	69	83	81	86	77	88	83	72	73	88
DEMO30	101	137	73	83	57	79	93	149	100	119	90	130
DEMO31	130	95	137	72	146	104	143	64	51	107	176	33
DEMO32	173	140	84	284	131	259	142	86	233	20	216	191
DEMO33	178	165	177	144	156	148	171	145	178	138	172	176
DEMO34	158	13	160	119	205	209	196	197	171	213	128	191
DEMO35	82	129	195	120	178	163	54	64	271	85	278	28
DEMO36	28	144	64	132	56	87	155	149	1	67	86	22
DEMO37	94	71	108	99	82	102	85	78	80	99	118	112
DEMO38	147	135	146	158	165	119	102	116	121	145	141	80
DEMO39	20	310	177	159	158	185	156	73	222	215	76	157
DEMO40	174	71	414	27	191	367	230	198	248	354	118	228
DEMO41	213	217	212	223	192	156	177	151	144	171	171	151
DEMO42	160	172	195	175	223	202	115	161	225	253	70	252
DEMO43	70	29	97	74	94	10	68	84	76	36	77	5
DEMO44	190	200	5	234	135	15	85	101	114	1	101	159
DEMO45	118	116	120	134	125	121	138	141	144	137	97	154
DEMO46	126	154	180	169	100	131	163	180	112	172	137	76
DEMO47	177	194	236	67	317	270	108	111	161	122	113	112
DEMO48	524	280	141	228	96	1	84	149	165	352	88	412

この表は、後の図でも使う人工発現量です。A1〜A6とB1〜B6が各条件の6反復で、DEMO01〜48は架空の遺伝子名です。実際のRNA-seqのリード数ではありません。

実際のカウントは、RNA量だけでなく試料ごとに読み取った総量などにも左右されます。条件間で比べる前に、その違いを考慮する正規化が必要です。

5. 発現量の変化

fold changeは発現量の比です。ここでは条件Bの平均を対照Aの平均で割ります。その比を2を底とする対数で表したものが、log₂ fold changeです。

条件B / 対照A	log₂ fold change	意味
2	+1	Bで2倍
1	0	同じ
0.5	−1	Bで半分

正ならBで多く、負ならBで少なくなります。比較の向きを逆にすると、符号も逆になります。

6. p値と多重検定

平均が違っていても、試料のばらつきで説明できるかもしれません。p値は、差がないという仮定と検定の前提のもとで、観測された差以上に極端な結果が出る確率です。「差がない確率」そのものではありません。

多数の遺伝子を同時に調べると、偶然小さなp値になるものも増えます。この教材ではBenjamini–Hochberg（BH）法でp値を調整し、調整済みp値を使います。

変化の大きさとp値は別の指標です。p値が小さいことだけで、生物学的に重要とは判断できません。

7. ボルケーノプロット

表の1行を、図の1点にします。1点は1遺伝子です。

横軸

log₂ fold change

変化の方向と大きさ。左はBで少なく、右はBで多い。

縦軸

−log₁₀ 調整済みp値

上に行くほど調整済みp値が小さい。

遺伝子の表とボルケーノプロット

人工データ · 全48遺伝子

条件Bと対照Aの比較。DEMO01〜48は架空の遺伝子です。原論文のshCaN実験ではありません。

◆ 模式セットA○ セット外色・形はセットへの所属を表します

人工遺伝子の変化量とBH調整済みp値。遺伝子名で選択。
遺伝子	log₂ FC	調整済みp
	-1.75	0.010
	-1.36	0.010
	-1.30	0.104
	+0.87	0.325
	-0.57	0.016
	-0.24	0.233
	-0.22	0.747
	+0.60	0.396
	+0.68	0.010
	+1.18	0.010
	+1.38	0.010
	+1.30	0.016
	-1.72	0.010
	-1.42	0.071
	-0.61	0.208
	-0.73	0.464
	-0.40	0.010
	-0.13	0.733
	-0.52	0.397
	+0.11	0.876
	+0.64	0.010
	+1.06	0.010
	+0.95	0.016
	+1.87	0.010
	+0.11	0.325
	-0.46	0.030
	-0.14	0.876
	-0.60	0.396
	+0.06	0.692
	+0.36	0.264
	-0.25	0.718
	-0.27	0.733
	+0.02	0.906
	+0.34	0.448
	-0.15	0.876
	-0.09	0.906
	+0.04	0.876
	-0.30	0.126
	-0.17	0.876
	+0.15	0.876
	-0.33	0.042
	-0.07	0.876
	-0.11	0.876
	-0.47	0.690
	+0.14	0.337
	-0.03	0.906
	-0.79	0.104
	-0.02	0.972

選択中の遺伝子

DEMO01

◆ 模式セットAに含まれる

log₂ fold change: -1.75
条件B / 対照A: 0.30 倍
調整済みp値（BH）: 0.010

上下の位置とセットへの所属は別です。発現量の変化だけでは、原因や働きまでは分かりません。

人工データの生成条件と計算方法

全48遺伝子、対照Aと条件Bを各6反復。独立な正規乱数を整数に丸め、1未満は1とした任意単位の模擬発現量です。乱数シードは20261023。基準量は80〜200、標準偏差は基準量の0.12 / 0.25 / 0.45 / 0.65倍。Bの期待値は、最初の24遺伝子では基準量×2のe乗（e = −1.6 + (0始まりの番号 mod 12)×0.29）、残りはe = (番号 mod 5 − 2)×0.07です。セットAは番号 mod 6 が0または1の遺伝子として事前定義しています。

横軸は反復平均の比のlog₂。p値は12個の値を6対6に分ける全924通りの、平均差の絶対値を使った両側の正確置換検定から計算し、全48検定をBH法で調整しています。ライブラリサイズの正規化やRNA-seq特有の分布を扱う解析ではなく、統計的な指標を読むための簡略例です。実データの解析には、その実験に合った手法が必要です。

選択中のDEMO01：対照A [80, 97, 73, 79, 73, 87]、条件B [38, 14, 23, 34, 16, 20]。

8. 遺伝子セット

遺伝子セットは、既知の機能や過去の研究などに基づいて定義した遺伝子の集まりです。細胞周期や免疫応答に関わる遺伝子などが例です。一つの遺伝子が複数のセットに入ることもあります。

セットは比較の結果を見る前に決めます。変化の大きかった遺伝子だけを後から集めれば、「変化が大きい」のは当然になってしまいます。

この教材の「セットA」は、全48遺伝子のうち16遺伝子を、発現量とは独立に番号で決めた模式セットです。図の◆がセットA、○がセット外を表します。実在の機能を持つ集まりではありません。

9. 過剰代表解析

過剰代表解析（ORA）は、選んだ遺伝子群に、あるセットの遺伝子が多く含まれるかを調べます。比較の基準となる遺伝子全体を背景集合と呼びます。

例として、Bで減少の大きい12遺伝子を選び、セットAの割合を全48遺伝子での割合と比べます。

全48遺伝子のセットA16 / 48遺伝子33.3%

Bで減少の大きい12遺伝子のセットA6 / 12遺伝子50.0%

選んだ12遺伝子では、セットAの割合が高くなっています。ただし、ここでは割合だけの比較です。本来のORAでは、偶然でもこの偏りが起こりうるかを統計的に評価します。選ぶ基準や背景集合によって結果は変わります。

10. GSEA

GSEA（遺伝子セットエンリッチメント解析）は、一部の遺伝子だけを選ぶのではなく、順位づけた遺伝子全体を使います。セットの遺伝子が、順位のどちら側に集まっているかを調べます。

ここでは全48遺伝子をlog₂ fold change順に並べます。セットAの遺伝子で上がり、セット外で下がる曲線を描くと、順位の偏りが見えます。

遺伝子の順位とセットA

人工データ · 全48遺伝子

並び順

◆はセットA。log₂ fold change順。
順位 / 遺伝子	log₂ FC
01·DEMO24	+1.87
02·DEMO11	+1.38
03·DEMO12	+1.30
04·DEMO10	+1.18
05·DEMO22	+1.06
06·DEMO23	+0.95
07·DEMO04	+0.87
08·DEMO09	+0.68
09·DEMO21	+0.64
10◆DEMO08	+0.60
11·DEMO30	+0.36
12·DEMO34	+0.34
13·DEMO40	+0.15
14·DEMO45	+0.14
15◆DEMO20	+0.11
16◆DEMO25	+0.11
17·DEMO29	+0.06
18◆DEMO37	+0.04
19·DEMO33	+0.02
20·DEMO48	-0.02
21·DEMO46	-0.03
22·DEMO42	-0.07
23·DEMO36	-0.09
24◆DEMO43	-0.11
25·DEMO18	-0.13
26·DEMO27	-0.14
27·DEMO35	-0.15
28·DEMO39	-0.17
29◆DEMO07	-0.22
30·DEMO06	-0.24
31◆DEMO31	-0.25
32◆DEMO32	-0.27
33◆DEMO38	-0.30
34·DEMO41	-0.33
35·DEMO17	-0.40
36◆DEMO26	-0.46
37◆DEMO44	-0.47
38◆DEMO19	-0.52
39·DEMO05	-0.57
40·DEMO28	-0.60
41·DEMO15	-0.61
42·DEMO16	-0.73
43·DEMO47	-0.79
44·DEMO03	-1.30
45◆DEMO02	-1.36
46◆DEMO14	-1.42
47◆DEMO13	-1.72
48◆DEMO01	-1.75

00 / 48

開始点セットAで上がり、セット外で下がる

0.00

◆はセットA。点線は全48遺伝子をたどった曲線です。現在の並び順で、絶対値が最大のスコアは-0.41。横軸は時間ではありません。

スコアの計算方法

セットAの16遺伝子では1 ÷ 16、それ以外の32遺伝子では−1 ÷ 32を足します。上昇の合計は+1、下降の合計は−1なので、最後は0に戻ります。重みづけ、NES・FDRの計算は行っていません。

これは重みなしの簡略例です。本来のGSEAでは、順位指標による重みづけや置換による評価などを行います。この曲線から論文のNESやFDRは計算していません。

11. 原論文の図5

Satoら（PNAS, 2024）は、ヒト乳がん由来のMCF7細胞を使って、カルシニューリンとE2F1の関係を調べています。E2F1は、遺伝子の発現を調節する転写因子の一つです。

この論文のshCaNは、カルシニューリンのCaN Aαを減らすためのshRNAです。E2F1を直接狙うshRNAではありません。

原論文 · Figure 5

条件
CaN AαをノックダウンしたMCF7細胞と、対照の細胞を比較しています。
凡例
図5Bの赤い点はHallmark E2F標的遺伝子です。「赤＝有意差あり」ではありません。
分布
図5Bで個々の遺伝子の変化、図5C–Eで遺伝子セット全体の偏りを見ます。曲線を読む前に、比較の向きと順位指標を確かめます。
結論
著者らは、CaN Aαを減らすとE2F標的遺伝子群の発現が低下することを示しています。ただし、発現の変化だけでは、直接結合やタンパク質分解の仕組みまで証明できません。

図5C–EのNESは正規化されたエンリッチメントスコア、FDRは偽発見率に関する指標です。一部の遺伝子を抜き出した表から、論文の値を再現することはできません。

12. 確認問題

カウント表の1行と1列は何を表す？

1行は1遺伝子、1列は1試料です。複数の試料から、条件の違いと試料間のばらつきを調べます。

ORAとGSEAは、どこが違う？

ORAは、選んだ遺伝子群にセットの遺伝子が多いかを背景全体と比べます。GSEAは、順位をつけた遺伝子全体のなかでセットが偏っているかを見ます。

shCaNは、E2F1のDNAを消す操作？

違います。CaN Aαを標的としてmRNAを減らす仕組みを利用する操作です。E2F1を直接狙うものでも、DNAを消すものでもありません。

ボルケーノの赤い点は、必ず有意差がある？

色の意味は凡例によります。原論文の図5BではHallmark E2F標的遺伝子を示します。点の高さと色の意味は別です。

用語

カウントデータ: 項目ごとに数えた個数のデータ。
遺伝子セット: 既知の機能や過去の研究などに基づいて定義した遺伝子の集まり。
ノックダウン: 特定の遺伝子産物の量を減らす操作。DNAをなくすこととは異なる。
RNA-seq: RNA由来の配列を読み取り、遺伝子の発現量などを調べる方法。
エンリッチメント: 比較の基準に対して、ある集まりが相対的に多く含まれることや、順位の片側に偏ること。
FDR: 発見とした結果の中に、誤った発見が含まれる割合に関する指標。

出典とデータ

Sato Y, et al. Calcineurin-mediated dephosphorylation stabilizes E2F1 protein by suppressing binding of the FBXW7 ubiquitin ligase subunit. PNAS 121, e2414618121 (2024). 原論文（DOI） · 全文・図5
GSEA User Guide
DRA011729 — 原論文で参照されるRNA-seqデータ。

商品48件は架空、遺伝子48件は人工データです。論文の実測データやMSigDBのセットは使用していません。論文図はリンク先で参照できます。